Малекулярна-біялагічныя метады даследавання і іх выкарыстанне

Малекулярна-біялагічныя метады даследавання гуляюць вялікую ролю ў сучаснай медыцыне, крыміналістыцы і біялогіі. Дзякуючы дасягненням у галіне вывучэння ДНК і РНК, чалавек здольны вывучыць геном арганізма, вызначыць ўзбуджальніка захворвання, распазнаць патрэбную нуклеінавых кіслот у сумесі кіслот і г.д.

Малекулярна-біялагічныя метады даследавання. Што гэта такое?

Яшчэ ў 70-80-х гадах навукоўцам упершыню атрымалася расшыфраваць геном чалавека. Гэта падзея дало штуршок развіццю геннай інжынерыі і малекулярнай біялогіі. Вывучэнне уласцівасцяў ДНК і РНК прывяло да таго, што зараз можна выкарыстоўваць гэтыя нуклеінавыя кіслаты ў мэтах дыягностыкі захворвання, вывучэння генаў.

Атрыманне ДНК і РНК

Малекулярна-біялагічныя метады дыягностыкі патрабуюць наяўнасці зыходнага матэрыялу: часцей гэта нуклеінавыя кіслаты. Існуе некалькі спосабаў вылучэння гэтых рэчываў з клетак жывых арганізмаў. Кожны з іх мае свае добрыя якасці і недахопы, і гэта трэба ўлічваць пры выбары метаду выдзялення нуклеінавых кіслот у чыстым выглядзе.

1. Атрыманне ДНК па Мармуру. Метад складаецца ў апрацоўцы сумесі рэчываў спіртам, у выніку чаго чыстая ДНК выпадае ў асадак. Мінусам гэтага спосабу з'яўляецца выкарыстанне агрэсіўных рэчываў: фенолу і хлараформу.

2. Вылучэнне ДНК па Буму. Асноўнае рэчыва, якое выкарыстоўваецца тут, - гэта гуанидин тиоционат (GuSCN). Яно спрыяе асаджэнні дэзаксірыбануклеінавай кіслаты на спецыялізаваных субстратах, з якіх у наступным можна яе сабраць з дапамогай спецыяльнага буфера. Аднак GuSCN - гэта інгібітар ПТЦ, і нават невялікая яго частка, якая трапіла ў абложаную ДНК, можа паўплываць на ход палімеразнай ланцуговай рэакцыі, якая гуляе важную ролю пры працы з нуклеінавых кіслот.

3. абложанага прымешак. Метад адрозніваецца ад папярэдніх тым, што абложваюцца не самі малекулы дехоксирибонуклеиновой кіслаты, а прымешкі. Каб гэта ажыццявіць, выкарыстоўваюць ионообменники. Недахоп у тым, што не ўсе рэчывы могуць аблогу.

4. Масавы скрынінг. Выкарыстоўваецца той спосаб у тых выпадках, калі не патрэбныя дакладныя звесткі пра склад малекулы ДНК, а неабходна атрымаць нейкія статыстычныя дадзеныя. Тлумачыцца гэта тым, што структура нуклеінавых кіслаты можа пашкодзіцца пры апрацоўцы дэтэргентам, у прыватнасці, шчолачамі.

Класіфікацыя метадаў даследавання

Усе малекулярна-біялагічныя метады даследавання дзеляцца на тры вялікія групы:

1. Амплификационные (з выкарыстаннем мноства ферментаў). Сюды адносіцца ПЦР - палімеразную ланцуговая рэакцыя, якая гуляе вялікую ролю ў многіх з метадаў дыягностыкі.

2. Неамплификационные. Гэтая група метадаў звязана непасрэдна з працай сумесяў нуклеінавых кіслот. Прыкладамі з'яўляюцца 3 выгляду блоттингов, in situ гібрыдызацыя і г.д.

3. Метады, заснаваныя на распазнанні сігналу ад малекулы зонда, які звязваецца з пэўнай ДНК або РНК зонда. Прыклад - сістэма гібрыдызацыі ў растворы Hybride Capture System (hc2).

Ферменты, якія могуць выкарыстоўвацца ў малекулярна-біялагічных метадах даследавання

Многія метады малекулярнай дыягностыкі маюць на ўвазе выкарыстанне шырокага дыяпазону ферментаў. Ніжэй прадстаўлены прымяняюцца найбольш часта:

1. Рестриктаза - «рэжа» малекулу ДНК на неабходныя часткі.

2. ДНК-полимераза - сінтэзуе двухцепочечной малекулу дэзаксірыбануклеінавай кіслаты.

3. Зваротная транскриптаза (ревертаза) - выкарыстоўваецца для сінтэзу ДНК на матрыцы РНК.

4. ДНК-лигаза - адказвае за адукацыю фосфодиэфирных сувязяў паміж нуклеатыдаў.

5. Экзонуклеаза - выдаляе нуклеатыдаў з канцавых участкаў малекулы дэзаксірыбануклеінавай кіслаты.

ПЦР - асноўны спосаб амплификации ДНК

Палімеразную ланцуговая рэакцыя (ПЦР) актыўна выкарыстоўваецца ў сучаснай малекулярнай біялогіі. Гэта метад, пры якім з адной малекулы ДНК можна атрымаць велізарная колькасць копій (амплифицировать малекулы).

Асноўныя функцыі ПЦР:

- дыягностыка захворванняў;

- кланаванне участкаў ДНК, генаў.

Для правядзення палімеразнай ланцуговай рэакцыі неабходныя наступныя элементы: зыходная малекула ДНК, термостабильная ДНК-полимераза (Taq або Pfu), дезоксирибонуклеотид-фасфаты (крыніцы азоцістых падстаў), праймер (2 праймер на 1 малекулу ДНК) і сама буферная сістэма, у якой магчыма правядзенне ўсіх рэакцый.

ПЦР складаецца з трох этапаў: дэнатурацыя, адпал праймер і элангацыях.

1. дэнатурацыя. Пры тэмпературы 94-95 градусаў па Цэльсіі просходит разрыў вадародных сувязяў паміж двума ланцугамі ДНК, і ў выніку мы атрымліваем дзве одноцепочечные малекулы.

2. Адпал праймер. Пры тэмпературы 50-60 градусаў па Цэльсіі адбываецца далучэнне праймер на канцах одноцепочечных малекул нуклеінавых кіслаты па тыпу кампліментарнай.

3. элангацыях. Пры тэмпературы 72 градусаў адбываецца сінтэз даччыных двухцепочечной малекул дэзаксірыбануклеінавай кіслаты.

Секвенирование ДНК

Малекулярна-біялагічныя метады даследавання часта патрабуюць веды паслядоўнасці нуклеатыдаў ў малекуле дэзаксірыбануклеінавай кіслаты. Для вызначэння генетычнага кода праводзіцца секвенирование. Малекулярная дыягностыка будучага будзе заснаваная на ведах, атрыманых пры вызначэнні паслядоўнасці чалавека.

Вылучаюць наступныя віды секвенирования:

• секвенирование па Максаму-Гілберт;
• секвенирование па Сэнгер;
• пиросеквенирование;
• нанопоровое секвенирование.